Peter Parker 是一名普通的大学生，自从被一只变异的蜘蛛咬伤之后，便具备了非凡的超能力，他能像蜘蛛一样，依附在任何物体的表面上。他利用自己的超能力与罪恶势力作斗争。在蜘蛛侠3中，Tobey Maguire仍旧扮演的是品性温和的大学生 Peter Parker。Peter在现实生活中不停的以两种身份出现在众人的面前：一个无所不能得超人和一个普普通通的在校大学生。在蜘蛛侠3中，Peter遇到了劲敌Otto Octavius之后，Peter的生活变得更为复杂。
　　《蜘蛛侠3》有三个大反派：毒液人、沙人和绿魔二代，沙人是本集中的头号大坏蛋，他那发亮的身体，能够变成像沙一样的物质，到处流窜；而毒液人则是在蜘蛛侠身体中注射进一种外层空间陨石物质，让蜘蛛服变黑，虽然表面上蜘蛛侠的功力增强不少，但事实不然，毒液人其实就像是坏蛋版的蜘蛛侠，他的衣服胸口也有蜘蛛图案；绿魔二代则是第一集绿魔死后，绿魔儿子哈利接下来扮演的复仇角色。
　　在《蜘蛛侠3》中，只有在开头和结尾的部分，蜘蛛侠才会穿上原本的红蓝色蜘蛛服，而在电影的大部分时间中，蜘蛛侠都是以黑色造型出现，而蜘蛛侠和女友的感情也更进一步，只不过电影内容已暗示，二人最后似乎会以悲剧收场。